1. 用途

   RIDASCREEN® FAST Zearalenon采用竞争性的酶免疫分析法定量分析谷物饲料中的玉米赤霉烯酮。试剂盒中含有酶免疫分析法所用的所有的试剂。试剂盒可以进行48个试验，包括标准。定量分析要求使用酶标板读数仪（含450nm波长）。

2. 概要

玉米赤霉烯酮毒素是由镰刀菌属的真菌形成。玉米赤霉烯酮主要呈雌激素效应。因为雌激素的特性，玉米赤霉烯酮会导致血中雌激素增高，临床表现为动物繁殖能力下降症状。具有关报道，动物中以猪zui为敏感，同时牛、马、羊也受其影响。这种霉菌毒素来源于植物或动物食品，会潜在威胁人体健康。为了检测食物及饲料中的玉米赤霉烯酮，常用物理/化学的方法，诸如HPLC，DC和GC，但这些方法在样品准备上耗时长，需要昂贵的实验室设备，而用RIDASCREEN® FAST Zearalenon检测方法，则能快速、准确地检测谷物、饲料、啤酒中的玉米赤霉烯酮。

3.测定原理

测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对玉米赤霉烯酮毒素的小鼠IgG羊抗体。加入、玉米赤霉烯酮毒素抗体，酶标记物，标准或样品溶液。游离、玉米赤霉烯酮与酶标记物竞争、玉米赤霉烯酮抗体，同时、玉米赤霉烯酮毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将红色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。

4.  提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行43个测量（附加5个标准分析孔），盒中的材料如下：

1 X 48孔板（6条X  8孔，可以拆分为单孔）包被有羊抗体

5 X 标准液, 1.3ml/瓶, 为玉米赤霉烯酮标准溶液

标准液浓度为：0ppb; 50ppb; 100ppb; 200ppb; 400ppb。

1 X 呕吐毒素抗体溶液（3ml）兔单克隆，直接应用液 黑色帽

1 X 酶标记的玉米赤霉烯酮（3ml），直接应用液       红色帽

1 X 基质/发色剂（6ml） 为红色溶液              白色滴瓶

1 X 反应停止液1M硫酸（6ml）                  黄色滴瓶

样品浓度可以直接从标准曲线中读出，已经考虑了样品制备过程的稀释倍数为10。

5.  需要的材料但盒中不提供

----5.1设备

----微孔板酶标仪（450nm）定量分析用

----振荡器

----粉碎机

----50ul, 100ul, 1000ul微量加样器

----100ml量筒

----50ml 漏斗及容量瓶

----WhatmanＮｏ１或相当的滤纸

5.2 试剂

---甲醇

---70%甲醇溶液：30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。

----蒸馏或去离子水

6. 操作者应该注意之事项

----标准液含有玉米赤霉烯酮毒素，应特别小心

----使用过的玻璃容器及玉米赤霉烯酮溶液用pH7的次

   氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜

----反应停止液为1M硫酸,避免接触皮肤

----不要使用过了有效日期的试剂盒, 稀释或搀杂使用会引起 

   灵敏度的降低.

----不要交换使用不同批号的盒中试剂.

7. 储存条件

----保存试剂盒于2-80C.不要冷冻

----基质/发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下

----将不用的微孔板放进原 锡箔袋中并且与提供的干燥剂

  一起重新密封.

8. 试剂变质的迹象

红色的基质/发色试剂显蓝色,表明基质/发色剂变质,应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时,表示试剂可能变质

9. 样品处理 （样品应当在暗处及冷藏保存）

----取5g粉碎的有代表性的样品与25ml 70%甲醇溶液混合

----强力振荡3分钟

----用Whatman No.1滤纸过滤

----取50ul稀释液进行分析

*根据需要可以增加样品量，但甲醇溶液的量也应相应增加。 

10. 酶标免疫分析程序

10.1测定之前注意事项。

1. 使用之前将所有试剂回升至室温（20-25oC）。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8 oC。

3. 如果样品量大建议使用多通道移液器，在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的*性,仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖子盖住微孔。

10.2包被有抗体的微孔板条

锡箔袋沿横向压皱外边打开.取出需用数量的微孔板及框架, 将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封, 保存于2-80C.不要冷冻.

10.3标准液

玉米赤霉烯酮标准液为直接应用液，已经考虑了样品制备的10倍稀释，因此样品中的玉米赤霉烯酮毒素的浓度可以直接从标准曲线读出。

10.5测定程序,在20-25 oC条件下操作

1. 根据样品量将足够数量的孔条插入微孔架，记录样品及标准位置。

2. 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50ul酶标记物到微孔底部, （红色盖）。（ 注意移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染。）

4. 加入50ul抗体溶液（黑色盖）到每一个微孔底部，充分混合，在室温（20-25°C）孵育10（+/-1）分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的*，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

5. 倒出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体.用洗瓶或多通道移液器将250ul蒸馏水加入孔中。再次倒出孔中的液体,完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。（移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤液造成洗板不彻底。洗板后要立即进行下一步操作，避免板孔干躁造成重复性差）

6．加入 2滴（或100ul）基质/发色试剂（白色滴瓶）到微孔

中, 充分混合并在室温（20-25°C） 暗处孵育5（+/-0.5）分钟（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的*，使用多通道移液器加液，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。

7． 加入 2滴（或100ul）反应停止液（黄色滴瓶）到微孔中混合好, （注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请将所需数量的滴瓶中液体转移至V型试剂槽中，并用多通道移液器加液。）在450nm处测量吸光度值以空气为空白，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值

11. 结果

定量分析：所获得的标准和样品吸光度值除以*个标准（0标准）的吸光度值再乘以100.因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

----------------------------------x 100=   %吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应伏呕吐毒素浓度（ug/kg）的半对数坐标系统曲线图, 相对应每一个样品的浓度（ug/kg）可以从标准曲线上读出.

RIDASCREEN FAST Fumonisin标准曲线见英文原版说明书

仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于（吸光度高）还是大于（吸光度低）标准值。

目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于（颜色深）还是大于（颜色浅）标准值。特别注意请在步骤6中将在室温暗处孵育5分钟 更改为2-3分钟。

12．灵敏度

各种不同谷物和混合饲料的检测限为17～41ppb。定量检测限为50ppb（50ug/kg）。

r-Biopharm拜发公司, r-Biopharm Rhone LTD拜发罗恩公司

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