黄曲霉毒素B1检测卡

使用说明书，使用前请仔细阅读，中文翻译件仅供参考

产品编号P27

试剂盒组成，可以进行20个样品的测定

10 个卡 密封于铝箔袋中，每卡可以测定两个样品

20个样品纯化柱

20个样品瓶，每瓶含有3ml样品稀释缓冲液

1瓶洗涤缓冲液，4ml 绿色标签

1瓶停止液，4ml 黄色标签

2 个安瓶，含有冷冻干燥的酶标记物，红色标签

1瓶酶标记物稀释缓冲液，5ml 粉色标签

1个安瓶，含有5ml 底物，兰色标签

20个滤液收集管

需要的材料但盒子中不提供

实验室天平

刀片式均质器，带有1L容器罐

蒸馏水或去离子水

色谱级甲醇

Whatman N0113或 N04滤纸（可用国产定性或定量滤纸替代）

100ul, 0.5-1.0ml移液器及匹配的吸头

实验室玻璃容器

过滤漏斗

100ml及500ml量筒

烧杯

重要注意事项

危险性

黄曲霉毒素是非常有害的物质,在实验中应当自始致终穿戴保护服装,包括橡胶手套,安全眼镜,实验大褂.

所有使用过的材料及试剂必须经过次氯酸钠溶液（约5%W/W）浸泡至少30分钟,然后加入丙酮（5%V/V） 再浸泡30分钟.以达到消毒的目的. 重复使用的实验用具应当用清水冲洗干净后用蒸馏水*洗涤.

可用本试剂卡检测的样品

花生,谷物，饲料，中草药及调味品

特别提示

1.不要使用过了有效期的试剂盒

2.不要混用不同批号的试剂,不要使用其他厂商的试剂代替.

3.试剂盒在使用之前应当回至室温（20-28OC）,需要至少30分钟

4.避免试剂长时间在室温放置,取出所需要的试剂后,其余应立 

  即密封好放回2-8OC

5.如果孵育时间与要求的不符,会导致结果不准确. 

6.移液器吸头在使用之前应当用原液润湿

7.蒸馏水温度应当为室温（20-28OC）

储存

试剂盒应当在2-8OC保存,不要冷冻

效期

如果试剂盒是在2-8OC保存, 自生产之日起有十个月的效期。酶标记物复溶后在2-8OC保存，可稳定4个月

样品制备

应当按照*认可的正式取样程序取样，以获得有代表性的样品。推荐zui少粉碎1公斤有代表性的样品，其中50g用于样品提取

用途及原理

AFLACARD B1速测卡是定性酶联免疫方法。这个筛选方法用于检测黄曲霉毒素B1的含量是否等于或大于2，5，10，15或20ppb。

由于耗时长，成本高，传统的黄曲霉毒素B1检测方法已经不适应产品的常规检测。速测卡由于采用了单克隆抗体技术，因而具有特异性好，灵敏度高，快速，简单等优点

检测卡的关键组份是单克隆抗体联接在卡的膜上。接下来是毒素提取，样品稀释，纯化及透过卡膜。样品中的黄曲霉毒素B1被膜上的抗体结合，剩余的抗体空位与后加入的黄曲霉毒素B1酶标记物结合。当样品中的黄曲霉毒素B1增加时，剩余的抗体空位就会减少。然后洗涤膜以除去未结合的酶标记物。加入底物后，膜上结合有酶标记物的地方会显现紫色斑点。用于质控的紫色斑点确认实验进行正确。样品紫色斑点产生表明是阴性样品。加入反应停止液后，颜色反应会停止并留下*的实验记录（保存在黑暗处）。

测定程序

酶标记物的准备

加2ml酶标记物稀释缓冲液（粉色标签）到含有酶标记物的安瓶中（红色标签），复溶后使用前在室温（20-28OC）放置至少30分钟。如果不能当日消耗完，请转移到另一干净棕色可密封的瓶中，标记好内含物及复溶日期，在2-8OC保存。

酶标记物复溶后在2-8OC保存，可稳定4个月

样品提取

称50g精细粉碎了的样品，放入具有1L容量的均质器中。加入100ml 80%的甲醇水溶液（色谱级甲醇/蒸馏水 80/20 V/V）。高速均质2分钟。用滤纸过滤提取物，收集至少2 ml滤液。

根据需要的检测限，按表1取适量的滤液及 80%甲醇加入到稀释管中，颠倒数次混合好。取1ml稀释了的滤液转移到含有3ml样品稀释缓冲液的小瓶中，颠倒小瓶数次混合好瓶中液体。将小瓶中液体全部加入纯化柱中（盒中已提供），用活塞加压滴速通过纯化柱并收集纯化液于收集管中（盒中已提供）。如果纯化液不清亮，请用同一根柱子再次过柱，但要降低速度。此液可以用AFLACARD B1检测卡测定。

表1 

AFLACARD B1检测卡测定程序

注意：未曾使用的卡每个孔内有两个浅兰色的斑点，加入样品后会自动消失。每个孔分别含有样品区和质控区各一个，因此每卡可以测定两个样品。

1． 试剂盒在使用之前从冰箱中拿出，回升至室温（20-28OC）,需要至少30分钟

2． 检查卡的每个孔是否有两个浅兰色的斑点

3． 用移液器吸取500ul纯化过的滤液，加入到速测卡膜的中间，使其透过膜（见附图1. 这一过程需要的时间不会超过5分钟）

4． 当滤液透过膜后,加入100ul准备好的酶标记物复溶液到膜的中间, 使其透过膜

5． 当酶标记物透过膜后, 加入100ul洗涤缓冲液（绿色标签） 到膜的中间,使其透过膜,然后用柔软的吸水纸（优质纸手巾）沿孔的周围擦拭 

6． 加入100ul底物（兰色标签）到膜的中间,反应5分钟,加入底物后开始记时（严格控制反映时间）

7． 加入100ul停止液（黄色标签） 到膜的中间,当停止液透过膜后立即判读结果

注意：未曾使用的卡每个孔内有两个浅兰色的斑点，加入样品后会自动消失。

提醒：每卡可以测定两个样品，每孔测定一个样品。每孔有自己的内置质控

请注意：第二个孔必须在*个孔用后的8小时内使用。

判读测定结果

为了获得一个有效的测定结果，质控斑点必须变成清晰可见的紫色。样品斑点与质控斑点颜色的强度不必一样。

当样品斑点与质控斑点都有清晰可见的颜色产生，样品应当判断为是阴性；当样品斑点没有产生易见的颜色，应当判断为阳性

成功使用AFLACARD B1检测卡指南

l 试剂盒在使用之前回升至室温（20-28OC）,需要至少30分钟

l 酶标记物复溶后至使用前在室温（20-28OC）放置至少30分钟，以混合均匀。

l 每次吸样或吸试剂必须使用新的移液器吸头，吸头不能反复使用，应使用高质量的吸头

l 确认加入到膜上的底物中没有气泡

l 在孵育反应5分钟步骤，请使用记时器

以上为永远遵循的要点，永远！

参考文献略

 r-Biopharm拜发公司, r-Biopharm Rhone LTD拜发罗恩公司

 各种霉菌毒素检测试剂盒及免疫亲和柱