德国拜发甘油检测试剂盒

德国拜发甘油检测试剂盒

甘油检测试剂盒

（酶学试剂盒）

酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）

RIDASCREEN（产品编号：0 414 433）      30次检测

1. 简介

酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）此法适用于检测食品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妆品、药品（溶液、栓剂）、纸板、烟草及生物制品中的甘油。

2.  原理

甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化为3-磷酸甘油酯，ATP转化为ADP； 反应式为

                GK

Glycerol﹢ATP           L-glycerol-3-phosphate﹢ADP

上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可与PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯； 反应式为

           PK

ADP﹢PEP          ATP﹢Pyruvate

丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD； 反应式为

                  L-LDH

Pyruvate﹢NADH﹢H﹢       L-lactate﹢NAD﹢

被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下测量。

3.  试剂盒内容物

----瓶1共有3瓶，每瓶约有2g辅酶及缓冲液的混和物，包括：甘氨酰甘氨酸缓冲液， PH约7.4； NADH约7mg；ATP约22mg；PEP-CHA约11mg；硫酸镁

----瓶2约0.4ml悬浮物，包括：

丙酮酸激酶，约240U； L-乳酸酯脱氢酶，约220U

----瓶3约0.4ml甘油激酶悬浮物，约34U

----瓶4为甘油检测对照溶液（甘油检测对照溶液可不需要计算结果），此溶液使用时不需稀释。（效期见标签）

4.  检测溶液的制备 （10次）

----取出1瓶瓶1， 用11ml重蒸水溶解，使用时此溶液需在20-25℃持续回温约10分钟

----瓶 2不需稀释

----瓶 3不需稀释

5.  操作者应该注意之事项

使用前请仔细阅读，中文翻译件仅供参考

----瓶1约含500mg碳酸钠，应避免接触皮肤和呼吸器官，其他用于甘油检测的试剂不具有危险性

----实验之后，用过的试剂可作为实验室废料处理，但必须在当地法规允许的前提下

6.  储存条件

----瓶 1在2-8℃下保存（见标签），溶液1在2-8℃下可保存4天，溶液1使用前需回温至20-25℃

----瓶2及3在2-8℃下保存（见标签）

7.  样品处理

----直接取用无色，透明，中性的溶液或按稀释表格稀释后进行检测，体积为2.000ml

----过滤混浊溶液

----除去样品溶液中的二氧化碳气体

----加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8

----对于深颜色的样品溶液可不需稀释或者用PVPP或酰胺配成较高浓度的溶液如：1g/100ml

----粉碎或均质固体和半固体样品，用水抽提或溶解，而后过滤，通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或色素

----用Carrez试剂可脱去样品中的蛋白质

----用热水抽提样品中的脂肪（抽提温度需在脂肪的溶解度之上），冷却后可分离出脂肪，将余下物质转移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分钟而后过滤，热水抽提后用Carrez溶液澄清

8.  过程

1.  波长：340nm，Hg365nm或Hg334nm

2.  比色杯：光径1.0cm

3.  温度：20-25℃

4.  zui终体积：3.020ml

5.  对照空气（光路上无比色杯）或对照水读取读数

6.  样品溶液：1-40ug甘油/检测（体积为0.100-2.000ml样品体积）

7. 具体操作见如下表格

分别测样品与空白的吸光度值差，而后用样品吸光度值差减去空白吸光度值差可以得到如下公式

△A=（A1 ―A2）Sample―（A1 ―A2）blank

若想得到一个足够精确的结果，则测得的吸光度的单位至少为0.100单位。

如果吸光度值差△A在334及340nm下测得的值高于1.000或在365nm下测得的值高于0.500，如此则表明样品溶液中甘油的浓度较高。

需根据稀释表格进行样品的稀释

9.  计算

根据以下公式计算浓度

V×MW

C=-----------------------×△A（g/l）

ε×d×v×1000

V=zui终体积（ml）

V=样品体积（ml）

MW=被检测物质的摩尔质量

D=光径（cm）

ε=NADH的消光系数

340nm=6.3（1×mmol-1×cm-1）

Hg365nm=3.4（1×mmol-1×cm-1）

Hg334nm=6.18（1×mmol-1×cm-1）

甘油含量计算遵循如下公式

3.020×92.1

C=----------------------------×△A

ε×1.00×0.100×1000

2.781

=----------------×△A（g甘油/l样品溶液）

ε

如果样品溶液是稀释使用的，在计算结果时需乘以稀释系数F。

当分析固体或半固体时，测量前需称一定重量配制样品溶液，其结果需按下式计算

C 甘油（g/l样品溶液）

C甘油 =--------------------------×100（g/100g）

W 甘油（在样品溶液中）

10. 检测操作说明

被检样品中甘油含量在1ug至40ug之间。

为了得到一个足够的吸光度值差，样品溶液的浓度稀释在0.04g/L至0.4g/L之间。

稀释表格

如果测得的吸光度值△A较低，例如低于0.100，则样品溶液需重新配制，可由下列几种解决方法

1. 可多称出些样品或不要过分稀释。

2. 加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml，当然为了得到相同的zui终体积（样品和空白），加入的水的体积就要相应减少。所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。

11. 技术信息

加入悬浮物2（PK/L-LDH）后等待前反应进行*后是非常必要的。

12. 特性

此法特异性适于甘油的检测。

13. 灵敏度和检测限

1. zui小的吸光分辨率为0.005个吸光单位，相应的zui大样品体积为2.000ml，340nm下测量，则样品的甘油浓度为0.1mg/L；若样品体积为0.100ml，则样品的甘油浓度为2mg/L。

2. 340nm下，吸光度值差为0.020可导出检测限为0.4mg/L，相应的zui大体积为2.000ml。

14. 线性

从1ug甘油/检品（0.4mg甘油 /L样品溶液，样品溶液V=2.000ml）到40ug甘油/检品（0.4g甘油/L样品溶液，样品V=0.100ml）

15. 精确性

用同一样品溶液做平行测定时，其吸光度值差会有0.005至0.010的差异，样品体积为0.100ml，340nm下测量，相应的甘油浓度约为2-5mg/L；若样品是经过稀释的，则在计算结果时需乘以稀释倍数。

16. 干扰信息来源

ATP和PEP的缓慢水解同NADH的缓慢氧化均可导致缓慢的蠕变反应；空白和样品的吸光度值可不必逐一立即检测。

17. 检测过程中的干扰

1. 根据过程中所给定的时间甘油若能转化*，则可断定没有干扰发生。

2. 反应结束后，可加入一些甘油重新检测（定性或定量）：如果加入标准物质后，吸光度值会随之改变，则可断定没有干扰发生。

3. 操作过程中的错误和干扰可通过两个样品体积的平行实验测得（如0.100ml和0.200ml）：测得的吸光度值差应与样品体积成比例关系。

当测定固体样品时，可称取不同质量（如1g和2g）于同一100ml容量瓶中，测得的吸光度值差及样品的质量应与样品的体积成比例关系。

4. 样品所含物质带来的可能干扰可通过加入内标来控制：除去样品、空白及标准的检测外，样品加检测对照溶液也要检测的，测得的吸光度值差可计算干扰。

5. 通过回收试验可测定可能的损失：分别测定加入标准与不加入标准的样品，在误差范围之内可定量测定附加物。

18.  Carrez试剂的澄清作用

----移取液体样品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或称取足够重量的样品于100ml容量瓶中

----加入60ml重蒸水

----仔细加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5ml Carrez-Ⅱ-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）

----用氢氧化钠调节溶液PH于7.5-8.5，加入每一溶液后需充分混和，加水至容量瓶刻度，混和并过滤

19.  应用举例

1.果汁中甘油的检测

----稀释样品其浓度约在0.4g/L以下（见稀释表格）

----过滤混浊果汁，取用透明或淡色溶液用于检测

当分析深色果汁时（如：草莓汁和红葡萄汁）需要先脱色

具体操作

----在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP

----搅拌1分钟后过滤

----取透明溶液用于检测，该溶液可带有轻微颜色

2.酒中甘油的检测

----根据稀释表格将样品进行稀释

----实际上红酒不需脱色也可进行检测

3.啤酒中甘油的检测

----取5-10ml啤酒用玻璃棒搅拌约1分钟，除去其中的二氧化碳气体

----根据稀释表格稀释脱去二氧化碳气体后的样品

4.烟草制品中甘油的检测

----充分混合并绞碎样品

----精确称取1g样品于100ml容量瓶中

----加入约70mL水磁力搅拌约1小时20-25℃下，而后加水至刻度，混和并过滤

----移取25ml滤液于50ml容量瓶中

----加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液，5ml Carrez-Ⅱ-溶液及10ml氢氧化钠溶液，在加入每一溶液后均需充人混和

----加水至刻度混和并过滤，取滤液用于检（0.100ml-0.500ml）

5.化妆品中甘油的检测

6.发酵产品及生物培养基中甘油的检测

----置样品（可先经过离心）于80℃水浴中15分钟以停止酶的反应

----离心并取上层溶液（可根据稀释表格稀释）用于检测

----另外可用高氯酸或Carrez溶液脱除蛋白质

琼脂培养基需先均质，而后按以上方法进行操作。

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