麻痹性毒素检测试剂盒（过敏毒素）

麻痹性毒素检测试剂盒

Paralytic shellfish poison  PSP

酶标免疫分析定量检测麻痹性毒素试剂盒。德国R-Biopharm制造（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）。

Paralytic shellfish poison  PSP （产品编号：R1902）

Paralytic shellfish poison  PSP竞争酶免疫分析法定量检测肉样中的麻痹性毒素。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有48个试验孔包括标准试验。如果进行定量分析，必需有微孔板酶标仪。

样品处理     清洗，匀浆，10%盐酸煮沸，离心

样品处理时间

样品处理（10个样品）.………………….大约1.5小时

测试时间（与样品数量无关）.…………………1.0小时

检测限  麻痹性毒素.………………………………50ppb

回收率   …………………….…………………大约90%

交叉反应

Paralytic shellfish poison PSP.………………….………100%

Decarbamoyl PSP.……………………………….………20%

Gonyautoxine Ⅱ，Ⅲ.………………….………………70%

Neo PSP………………….……….………………….……12%

1. 用途

Paralytic shellfish poison PSP采用竞争酶免疫分析法定量分析贝类产品中的麻痹性毒素。

2.  概要

麻痹性毒素（PSP）是在多种水藻产生的潜在的神经毒素，通过食物链累积在贝类中。麻痹性毒素（PSP）引起呼吸麻痹，导致8 %的病例死亡，阻滞神经和肌肉隔膜的钠离子通道。致死量是1-3mg，在食入0.5-1.0µg的麻痹性毒素（PSP）临床表现麻木和呼吸障碍。

直到现在检测海藻毒素（贝类毒素）的方法，一直是小鼠活体实验，这种方法的局限性是结果的高变异性和低敏感性（近

似值370ppb，37µgPSP/100g样品），这种低灵敏度的方法使欧盟各成员国不得不分别给出了40µg-80µgPSP/100g样品这样特别有问题的允许限。此外，从动物保护观点看，这种方法也将引起很大的争议。

使用RIDASCREEN FAST PSP检测试剂盒能提供快速而准确的分析。

3. 测定原理

测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对麻痹性毒素（PSP）抗体的捕捉抗体，加入标准或样品溶液及麻痹性毒素（PSP）酶标记物，游离麻痹性毒素（PSP）与麻痹性毒素（PSP）酶标记物竞争麻痹性毒素（PSP）抗体，同时麻痹性毒素（PSP）抗体与捕捉抗体连接。没有结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm测量，吸光强度与样品中的浓度成反比。

4. 提供的试剂

每一个盒中的试剂足够进行48个测量（包括标准分析孔），盒中的材料如下

1× 48孔板（6条 ×  8孔）包被有针对麻痹性毒素（PSP）抗体的捕捉抗体。

6×麻痹性毒素（PSP）标准液，1.3 ml/瓶，标准液浓度为

0ppb，2.5ppb，5ppb，10ppb，20ppb，40ppb 直接应用

1× 酶标记物浓缩液（0.3ml）.………………….………红色帽

1× 抗体浓缩液（0.3ml）.……………………….………黑色帽

1× 基质/发色剂（6ml）.………………….……………白色滴瓶

1× 反应停止液1N硫酸（6ml）.……………….………黄色滴瓶

1× 缓冲液（50ml）

用于样品，酶标记物及抗体的稀释

5.  需要的材料但盒中不提供

5.1设备

----微孔板酶标仪（450nm）定量分析用

----离心机

----均质器

----磁搅拌器

----刻度移液管

----50µl，100µl，500µl微量加样器

5.2 试剂

----0.1M  HCl

6.  操作者应该注意之事项

----标准液含有麻痹性毒素（PSP），应特别小心，避免接触

----反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤

----不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起    灵敏度的降低

----不要交换使用不同批号的盒中试剂

7.  储存条件

----保存试剂盒于2-80C。不要冷冻。

----无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

----将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂    一起重新密封

8. 试剂变质的迹象

微红色的发色试剂有任何兰颜色产生，表明发色剂变质，应当弃之。

0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

9.  样品处理 

样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存

----除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质

----称取10g 均质后的样品加入10ml 0.1 M的 HCl（如果样品为较干燥的贝肉，请加入20ml 0.1M 的HCl，稀释系数等同），煮沸并搅拌5分钟

----离心：4℃下，3500g离心10分钟（离心后可能有悬浊，不影响结果）

----离心后控制pH值，用5N的盐酸调节到4.0以下

----取100µl上清液，用样品稀释缓冲液（1:10）稀释（1+9）

----取50µl用试剂盒进行分析，此时的稀释倍数是20

高浓度的样品，如超出标准曲线范围，进一步用样品稀释液1:10稀释（1+9），稀释系数为200

10. 酶标免疫分析程序

10.1测定之前注意事项

1. 使用之前将所有试剂回升至室温22-25℃。

2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3. 在使用中不要让微孔干燥。

4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的*性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。

5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。

10.2 酶标记物

提供的酶标记物（盖红色帽的瓶子）为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物。 在吸取浓缩液之前，要仔细地轻轻振摇。用缓冲液以1: 11的比例稀释酶标记物浓缩液（200µl浓缩液+2ml缓冲液，足够4个微孔板条用）。

10.3 抗体

提供的抗体 （盖黑色帽的瓶子）为浓缩液。由于稀释的抗体稳定性不好，所以只稀释实际需用量的抗体。在吸取浓缩液之前，要仔细地轻轻振摇。用缓冲液以1: 11的比例稀释抗体浓缩液（200µl浓缩液+2ml缓冲液，足够4个微孔板条用）

10.4包被有抗体的微孔板条

将锡箔袋回至室温后，沿横向边压封线外侧剪开，取出需用数量的微孔板及框架， 将不用的微孔板立即放回原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。不要冷冻。

10.5测定程序  （在20-25℃条件下操作）

1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。

2. 加入50µl的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。

3. 加入50µl稀释的酶标记物到微孔底部（红色盖），轻轻混合。

4. 加入50µl稀释的抗体到微孔底部（黑色盖），彻底混合，并且在室温孵育15分钟，覆盖上薄膜（防止蒸发）。如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器。（注意移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免交叉污染。）

5. 倒出孔中的液体， 将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250µl蒸馏水加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。（移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤用水造成洗板不彻底。洗板后要立即进行下一步操作，避免板孔干躁造成重复性差）

6. 加入 2滴（100µl）基质/发色试剂到微孔中（白色滴瓶）， 轻轻震荡并在室温暗处孵育15分钟。（注意此操作步骤要快，尽量保持前后孔孵育时间的*，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器加液。移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体。）

7. 加入 2滴（100µl）反应停止液到微孔中，（注意此操作步骤要快，如果实验所用孔数量多，请用多通道移液器加液。）混合好在450nm处测量吸光度值，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值。

11.  结果

定量分析：所获得的标准和样品吸光度值除以*个标准（0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。

标准的吸光度值（或样品）

-------------------------------× 100=   % 吸光度值

0标准的吸光度值

计算的标准值绘成为一个对应麻痹性毒素 （PSP）浓度（µg/kg）的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（µg/kg）可以从标准曲线上读出。

请注意

为了获得样品中的麻痹性毒素（PSP）的实际浓度（µg/kg），从标准曲线上读出的浓度值必须乘以相对应的稀释系数。当样品处理过程是按指示进行的，稀释系数为20，又一次稀释后系数为200。

12. 灵敏度

灵敏度为2.5ppb（µg/kg），根据样品处理稀释系数，检测下限为50ppb（µg/kg）

13. 特异性

RIDASCREEN FASTPSP（麻痹性毒素快速）试剂盒的特异性如下

Paralytic shellfish poison PSP.………………….………100%

Decarbamoyl PSP.……………………………….………20%

Gonyautoxine Ⅱ，Ⅲ.………………….………………70%

Neo PSP………………….……….………………….……12%

14. 重复性

15.  回收率

添加回收实验：贝肉…………………………….……约90%

16. 参考文献   见试剂盒中提供的英文原版说明书

17. 完成实验的关键注意点

1. 按要求将所有试剂回升至室温22-25℃，测量实验台面的温度为22-25℃。

2. 稀释酶标记物及抗体时，先移取缓冲液后移取被稀释物，避免稀释缓冲液被污染（注意换新吸头、移取前混均、稀释后混均）。不要使用塑料容器。

3. 将锡箔袋回至室温后，沿横向边压封线外侧剪开，取出需用数量的微孔板及框架， 将不用的微孔板立即放回原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。不要冷冻。

4. 洗微孔板时移液器管尖千万不要进入微孔板孔中，不要接触到放进孔中的液体，避免污染洗涤用水造成洗板不彻底。

5. 实验完毕后，如果容器再次使用，请认真洗净容器，不要造成容器的交叉污染，特别是不要将盛装过标准溶液的容器与其它容器同时洗涤（丢弃）。

所有吸头应该一次性使用，要使用高品质的吸头。